總結HPLC校正因子法在中藥雜質(zhì)定量方面應用的問(wèn)題

標準物質(zhì)一直是藥品質(zhì)量控制特別是純度和含量分析的重要選擇，但標準物質(zhì)的供需矛盾，如有些雜質(zhì)標準物質(zhì)不易獲取以及多個(gè)標準物質(zhì)同時(shí)使用所帶來(lái)的高昂檢測成本等限制了標準物質(zhì)的實(shí)際應用。為解決這一問(wèn)題，替代方法應運而生，高效液相色譜(HPLC)校正因子法便是其中之一。

該方法起初主要用于HPLC有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)對于特定雜質(zhì)的定量，進(jìn)而又逐漸用于中藥多指標含量的測定，發(fā)展至今相對校正因子用于雜質(zhì)的定量或者中藥多組分活性成分的定量方法已經(jīng)得到廣泛的應用，但是其在使用過(guò)程中還存在一些問(wèn)題需要統一或者規范，其在中藥方面的應用已經(jīng)有多人對相應的技術(shù)要求進(jìn)行過(guò)建議和總結，但在雜質(zhì)定量研究方面相關(guān)報道甚少，因此本文將文獻中相對校正因子在雜質(zhì)定量方面應用存在的一些問(wèn)題進(jìn)行了總結。

曲線(xiàn)是否需要強制過(guò)原點(diǎn)

對于色譜方法，校正曲線(xiàn)的斜率b=0是一種理想的狀態(tài)，事實(shí)上由于每一臺儀器都有其檢測限度，需要待分析物達到一定濃度水平以后才能檢測出信號，以及溶劑干擾等系統誤差的存在，因此截距一般不會(huì )為0。

正的Y軸截距表示高濃度響應的飽和度或響應處有干擾存在，負的截距說(shuō)明可能方法靈敏度有問(wèn)題，或被分析物質(zhì)殘留在容器或者HPLC系統中。但是標準曲線(xiàn)法使用斜率求取校正因子的前提是假設截距b=0，由此可見(jiàn)無(wú)論是否對截距進(jìn)行校正，這種方法對于相對校正因子的測定都會(huì )產(chǎn)生一定的誤差。

目前對于標準曲線(xiàn)法求校正因子的截距和斜率未檢索到明確的要求。因此文獻對于校正曲線(xiàn)的處理也有兩種方法，一種是將截距校正為0；大部分則未做校正。但校正因子在中藥方面的應用中有一些相關(guān)要求的報道，如校正曲線(xiàn)相關(guān)系數r不得低于0.999，k/b值大于100時(shí)，b值可以忽略不計。

實(shí)例證明在中藥多組分含量測定中采用截距校正后的曲線(xiàn)斜率求相對校正因子方法最為合理。但截距校正與否對校正因子計算會(huì )產(chǎn)生多大的影響，哪一種方式計算得到的雜質(zhì)含量更為準確未見(jiàn)文獻報道。

校正曲線(xiàn)濃度范圍的選擇

在進(jìn)行雜質(zhì)定量方法驗證時(shí)，線(xiàn)性驗證是方法驗證中不可少的一項內容，由于在驗證過(guò)程中要分別建立雜質(zhì)和主成分濃度和響應值之間的校正曲線(xiàn)，可以就此以?xún)尚Ｕ€(xiàn)的斜率計算出相對校正因子，因此很多研究對于校正曲線(xiàn)濃度的范圍便遵從線(xiàn)性驗證的要求從定量限到限度值的120%～150%。也有專(zhuān)家建議標準曲線(xiàn)法測定校正因子的濃度范圍要涵蓋定量限和標準限度。

從目前檢索到的文獻看，有些文獻的確涵蓋了定量限和標準限度，有些則僅涵蓋限度或未明確定量限，其中一些文獻上限定了限度水平的200%甚至500%，高濃度范圍對于溶液的配制可能更為簡(jiǎn)單，低濃度范圍則更加接近正常雜質(zhì)檢測水平，不同濃度范圍所得到校正因子是否有所差別未檢索到文獻報道。

校正曲線(xiàn)上濃度點(diǎn)的選擇

在計算相對校正因子時(shí)，多采用線(xiàn)性驗證時(shí)的校正曲線(xiàn)，因此一般要求至少制備5份不同濃度的對照品溶液用于校正曲線(xiàn)的繪制。在配置不同濃度的對照品溶液時(shí)應盡量采用逐級稀釋,在校正曲線(xiàn)上的點(diǎn)也應均勻分布，也有一些文獻濃度點(diǎn)分布并不均勻，如在低濃度處選點(diǎn)更加密集，曲線(xiàn)上濃度分布對校正因子的測定是否產(chǎn)生影響未見(jiàn)文獻報道。

涉及校正因子的方法開(kāi)發(fā)與驗證

目前對于雜質(zhì)與主成分相對校正因子的測定多在進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)方法線(xiàn)性驗證時(shí)直接以校正曲線(xiàn)的斜率順帶求得，僅在《中國藥典》2015年版四部《9101藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則》中明確規定了校正因子需進(jìn)行準確度驗證，但對于測定校正因子的方法開(kāi)發(fā)以及耐用性驗證沒(méi)有明確的要求。

在檢索到的有關(guān)化學(xué)藥品具體品種校正因子的26篇相關(guān)文獻中，有16篇文獻在計算相對校正因子時(shí)考慮到了儀器、色譜柱的相關(guān)影響，以在不同儀器不同色譜柱上測定得到的均值作為校正因子；有11篇文獻進(jìn)行了校正因子的耐用性驗證，但驗證項目不一，主要涉及人員、實(shí)驗室、儀器、色譜柱、流動(dòng)相pH值和比例、流速、試劑等級、柱溫、粒徑等多個(gè)影響因素，其中檢測波長(cháng)、色譜柱、柱溫、流速都被報道過(guò)對校正因子測定結果有顯著(zhù)影響。

由此可見(jiàn)，應該在方法開(kāi)發(fā)時(shí)對于特定雜質(zhì)相對校正因子的耐用性根據具體情況進(jìn)行全面考察，如果校正因子發(fā)生明顯變化，應對具體測試條件在方法標準中加以嚴格設定，這樣相對校正因子才能作為一個(gè)常數，直接載入質(zhì)量標準用于雜質(zhì)的準確定量。

隨著(zhù)大眾對于藥品安全性認識和需求的不斷提高，藥品有關(guān)物質(zhì)檢查中進(jìn)行特定雜質(zhì)控制會(huì )逐漸成為藥品質(zhì)控的常態(tài)，標準物質(zhì)無(wú)法及時(shí)供應的情況下，采用相對校正因子計算特定雜質(zhì)的方法也會(huì )越來(lái)越普遍。相對校正因子將成為藥品HPLC方法中用于雜質(zhì)含量測定和限度檢查過(guò)程中一個(gè)重要的參數。

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